来源：代谢组学样品衍生化不完全试剂配比（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
样本磨好了，蛋白除干净了，结果一针进GC-MS，峰稀稀拉拉，内标东倒西歪。这种憋屈，代谢组学人都懂。衍生化这一步，看着只是“加试剂、加热、进样”三个动作，实际上80%的故障都藏在这里。这篇教程不跟你堆理论，从低级错误到疑难杂症，按真实排查路径走一遍。你只需要照着动手，大概率能当场找出问题。
第一步：快速排查低级错误
先别急着怀疑仪器和试剂质量问题。新手翻车，通常翻在最基础的三件事上。
- 衍生化试剂过期或吸潮。 打开试剂瓶闻一下，有刺鼻酸味的直接扔。BSTFA、MSTFA这类硅烷化试剂开封超过3个月，吸潮后反应活性断崖式下降。解决：分装成1 mL小瓶，-20°C干燥保存，用前回温到室温再开盖。
- 样品里还残留水分。 水是硅烷化试剂的头号杀手。如果你的样品是氮吹后直接衍生化，手指摸一下管壁，感觉发凉或黏腻，说明还有微量溶剂或水。解决：氮吹后加50 μL无水吡啶，再涡旋吹干一次，用共沸带走残留水分。
- 反应体系里忘加催化剂或催化剂比例不对。 只用BSTFA不加TMCS，很多含氨基、羟基的代谢物反应极慢。解决：直接使用含1% TMCS的BSTFA，别自己配，配比一错全盘皆输。
排查完这些，如果问题还在，往下走系统性排障。
第二步：分维度系统排查
模块1：试剂配比与用量失控
现象： 同一批样本，出峰数量批次间差异大，羟基类代谢物（如葡萄糖、丝氨酸）峰面积忽高忽低。
原理： 衍生化试剂体积是相对样本干物质质量算的，不是随便加100 μL了事。样本基质复杂，消耗试剂的量差异极大。用体积比代替质量比，是配比失衡的根源。
排查动作链：
1. 判断： 先看内标（如肉豆蔻酸-d27）的峰面积。如果内标批次间RSD大于15%，试剂用量大概率不够。
2. 验证： 取同一份膀胱癌血清样本，分别加100 μL、200 μL、300 μL含1% TMCS的BSTFA（含0.1 mg/mL内标），60°C孵育30分钟。比较目标代谢物峰面积。你会看到100 μL时很多峰矮小，200 μL时达平台，300 μL时也不增加——说明200 μL是饱和量。
3. 解决： 按样本干重折算，每100 μg干物质加150～200 μL衍生化试剂。尿液样本冻干后盐多，加至250 μL。用带刻度的玻璃内衬管，别用塑料管（增塑剂会干扰）。
模块2：衍生化温度与时间组合错误
现象： 色谱图后段基线抬升，出现很多“鼓包峰”，目标峰背后拖着宽大的尾巴。
原理： 硅烷化反应是亲核取代反应，升温能加速，但超过80°C时，含羰基的代谢物（如丙酮酸）和还原糖易发生副反应。时间不够则反应不彻底，尤其需要肟化的羰基化合物。
排查动作链：
1. 判断： 你做的是不是全谱代谢组？如果是，别直接跳到硅烷化。先做肟化步骤没？没做的话，葡萄糖、果糖这类酮糖/醛糖会出现双峰或拖尾。
2. 验证： 取标准品混合物（含葡萄糖、甘氨酸、棕榈酸各1 mg/mL），分三组：甲氧胺吡啶（10 mg/mL）70°C孵育30分钟→BSTFA 60°C孵育30分钟；直接BSTFA 60°C孵育30分钟；直接BSTFA 80°C孵育15分钟。跑GC-MS，你会看到第一组葡萄糖出单峰、峰形对称，后两组要么双峰要么峰高掉一半。
3. 解决： 推荐条件：甲氧胺吡啶（10 mg/mL，用无水吡啶现配）30 μL，37°C孵育90分钟（过夜也没事）；再加80 μL BSTFA（含1% TMCS），60°C孵育30分钟。别用70°C以上长时间孵育。
模块3：溶剂残留与衍生化环境湿度
现象： 衍生化后样本变浑浊，或者空白进样在保留时间10～15分钟区域出现连续小峰，像“锯齿”。
原理： 吡啶吸水性极强。你氮吹后残留的微量水，会在衍生化时与BSTFA反应生成三甲基硅醇。这东西挥发慢，会污染进样口和色谱柱前端，造成鬼峰。
排查动作链：
1. 判断： 加完衍生化试剂，涡旋后看液体是否澄清。不是澄清透明的，大概率含水。
2. 验证： 空管加相同体积衍生化试剂，不盖盖子在通风橱放置10分钟再上机。若出现杂质峰，说明环境湿度偏高，或试剂本身已吸水。
3. 解决： 氮吹后加50 μL无水乙腈，涡旋，再氮吹。乙腈与水共沸，能把残留水分带走。衍生化时盖紧带PTFE垫的盖子，进样前不要开盖太久。
模块4：样本基质消耗试剂
现象： 血浆样本衍生化产物颜色明显比标准品深（黄褐色），峰面积却更低。
原理： 样本里残留的蛋白、磷脂、盐类会与衍生化试剂发生非特异性结合，相当于“吃掉”了一部分试剂。代谢物浓度低的样本，配比自然不够。
排查动作链：
1. 判断： 用沉淀蛋白后的上清液衍生化，还是复溶后直接衍生化？如果蛋白沉淀不彻底，衍生化时蛋白变性，释放的结合态代谢物又消耗试剂。
2. 验证： 取一份血浆，分成两份：一份直接氮吹衍生化；一份加-20°C冷丙酮（1:4）沉淀蛋白，14000 rpm离心10分钟取上清，氮吹衍生化。对比目标峰数量，后者普遍多2～3倍。
3. 解决： 常规血清/血浆样本，衍生化前用冷丙酮或乙腈沉淀蛋白（体积比1:4），涡旋1分钟，-20°C静置20分钟，14000 rpm离心10分钟，取上清氮吹。若脂质多，再用MTBE:水=3:1液液萃取，取有机相吹干。
第三步：进阶疑难问题
1. 同一批样本，个别样本衍生化后峰面积整体偏低
这种情况在尿液样本中常见。尿液pH波动大（5～8），酸性条件下羧基硅烷化效率高，碱性条件下氨基硅烷化效率高。不同样本pH不一致，导致各化合物衍生化程度偏离。解决：样本上样前统一调pH到6.5～7.0（用1M HCl或NaOH，每100 μL尿液加2～3 μL），再冻干或氮吹。别直接用原尿衍生化。
2. 衍生化后在自动进样器里放置超过6小时，峰面积不断下降
含氨基的代谢物（如谷氨酰胺、赖氨酸）硅烷化产物不稳定，容易发生脱硅烷化。解决：别用大体积进样瓶装全部样本。用200 μL内衬管分装，每管只够进2针的量。序列跑完一批再取下一批。如果必须长时间放置，将托盘温度降到10°C，并重新建立标准曲线校正。
3. 加了过量衍生化试剂后出现“双峰”或肩峰
试剂过量时，部分代谢物可能生成双硅烷化或三硅烷化产物，比如酪氨酸会出现两个保留时间接近的峰。解决：别一次加太多，按模块1的验证步骤找到饱和体积。已经出现双峰的样本，可以加入体系体积1/10的无水甲醇淬灭反应，再涡旋，双峰会减弱。
避坑总结+实操建议
1. 永远先跑标准品再做样本批。 衍生化试剂批次换了、隔了一个月没用、甚至天气湿度变了，都要用标准品混合物（氨基酸+有机酸+糖）验证峰形和峰面积。
2. 衍生化试剂计量按样本干重走，别偷懒。 统一用质量浓度100 μg干物质加150～200 μL试剂，记录每次的实际用量。
3. 怀疑衍生化问题时，别盲目调仪器参数。 先看内标和空白溶剂针，再决定是改试剂、改温度还是改净化步骤。
日常养成两个习惯：衍生化试剂每次用铝箔包住避光放置，用后立即封口膜密封；准备一个“衍生化记录本”，记下每次的试剂批号、配比、温度、湿度，故障时翻记录比猜快得多。
如果你是做靶向代谢组学或脂质组学，建议顺带用平台上的引物设计工具确认一下内标基因的稳定性，或在后续验证中调用密码子优化模块，减少因目标蛋白表达异常带来的基质干扰。工具入口在页面侧栏，复制序列进去就能用。