来源：单细胞测序建库丢核解离酶优化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做单细胞核转录组，最崩溃的不是数据不好，是根本没上机。裂解完镜下一看，核不见了；或者核全糊成一团，10x微流控芯片直接堵死。丢核和解离酶用错，是建库失败的头号杀手。这篇把从组织解离到场控质检的排查路径拆开讲，每个坑都给你现象、参数和验证动作，照着做能救回大半样本。
第一步：先别怀疑试剂，快速排查这4个低级错误
1. 离心力太大。细胞核比完整细胞轻得多，你用500 xg以上甩10分钟，核全贴壁压碎了。改成4°C、500 xg、5分钟，弃上清时留50 µL不吸干。
2. 缓冲液没加BSA。核膜疏水，管壁一粘就损失30%。裂解液和洗涤液里加0.04% BSA，全程用低吸附管。
3. 拿台盼蓝计数。核膜不完整，台盼蓝会染进去，你把好核当死核扔了。改用DAPI或吖啶橙，荧光计数。
4. 筛网没预湿、反复复用。40 µm筛网干着上样，核挂网上；第二管还用它，残核成团。每管换新筛，先用1 mL含0.04% BSA的PBS润洗。
第二步：按流程分维度系统排查
模块A 组织解离——酶选错、酶解过度
现象：解离液变黏，镜下一堆碎片，DAPI亮斑小而模糊；上机核浓度远低于计数。
原理：胰蛋白酶配胶原酶Ⅱ太猛。37°C超过15分钟，蛋白酶直接啃开核膜，染色质外漏，核一碰就碎。
解决步骤：
① 换温和酶：Liberase TM 0.1-0.2 mg/mL，或Accutase纯用，37°C只孵5-8分钟。
② 每3分钟吹打10次，用200 µL宽口枪头（剪掉尖端），别用1 mL细口猛吹。
③ 加等体积含10% FBS的DMEM终止，立刻转冰，过40 µm筛。
验证：取10 µL解离液，DAPI染色，荧光镜数完整圆形核占比。低于80%就是酶解过头，减时间或降酶浓度重做。
模块B 裂解——NP-40浓度和时间是两个旋钮
现象：核得率高但背景RNA高，或者核膜破、核变小而亮。
原理：NP-40浓度低，胞质没清干净，背景就高；浓度高或时间长，核膜也保不住。裂解要的是“破膜不破核”。
解决步骤：
① 起始配方：10 mM Tris-HCl pH 7.4、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、0.1% NP-40、0.1% BSA、1 mM DTT、0.4 U/µL RNase抑制剂，现配现用，冰上。
② 裂解5分钟，每2分钟轻弹管壁一次，禁止涡旋。
③ 裂解完立刻加5倍体积洗涤液（PBS+0.04% BSA）稀释，终止裂解。
验证：裂解2、5、10分钟各取5 µ